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猪细小病毒RT-PCR检测试剂盒说明书
标签:细小病毒RT-PCR试剂盒  来源:雅吉生物  2019-07-08  浏览:173次

 

 【产品名称】

通用名猪细小病毒PCR检测试剂盒

英文名称:Porcine pamovirus PCR Detection Kit

【包装规格】 25T/盒 & 50T/盒

【预期用途】

本试剂盒适用于猪细小病毒检测,不进行病毒分型,对猪细小病毒引起的流感及其并发症的诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

利用试剂盒提取DNA,在TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

组成

25T/盒

50T/盒

PPV  PCR反应液

375 μL×1管

750 μL×1管

PPV 混合酶液

75 μL×1管

150 μL×1管

PPV 阳性对照

40 μL×1管

40 μL×1管

PPV 阴性对照

40 μL×1管

40 μL×1管

说明书

1份

1份

注:阴性对照为猪基因组DNA,阳性对照为PPV经灭活处理的核酸提取物。

【储存条件及有效期】-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

【需自备的物品】

PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪、可调移液器琼脂糖等相关试剂及设备。

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力,操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性,必须使用不含DNA和RNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套,操作人员须戴口罩。

【实验准备】

如果是提取病毒RNA,请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【操作步骤】

1.样品处理:每份样品分别处理。

1)新鲜采集的咽拭子、鼻拭子和粪便标本,并使用灭菌生理盐水悬浮。

2)标本收集后若不能立即检测,可置于2~8℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-20℃~-80℃。

3)标本保存期间应避免反复冻融。

2. 提取过程:

QIAGENRoche公司DNA提取试剂盒提取DNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作

3. PCR扩增

1)每份总体积20 µL,15 µL PCR反应液(用前混匀),3µL 混合酶液,2 µL模板DNA。

例如:n份样品,配制n+1份,15×(n+1)PCR反应液, 3×(n+1)混合酶液匀后取18 µL分装成n份,分别加入2 µL模板DNA,作好标记。

2)在PCR扩增仪上进行以下程序: 94 ℃ 3 min;循环94℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min。

4. 电泳

1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中,加入1倍TAE电泳缓冲液100 mL(取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至100 mL),于微波炉中熔解,待冷却至50℃左右再加入50 µL染色液(自备)混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物中加入4µL上样缓冲液(自备)混匀后取10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中,以110~120V电压于1TAE电泳缓冲液中电泳,紫外灯下观察结果。(注:染色液是2000×,上样缓冲液是6×)

【结果判定】

阳性对照出现177 bp扩增带、阴性对照无带出现引物带除外时,实验结果成立。被检样品出现177 bp扩增带为猪细小病毒阳性,否则为阴性

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