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小反刍兽疫病毒RT-PCR检测试剂盒说明书
标签:小反刍兽疫病毒RT-PCR  来源:雅吉生物  2019-07-08  浏览:223次

 

 【产品名称】

通用名小反刍兽疫病毒RT-PCR检测试剂盒

英文名称Peste des Petits Ruminants Virus RT-PCR Detection Kit

【包装规格】25T/& 50T/

【预期用途】

本试剂盒利用PCR原理,定性检测小反刍兽疫病毒,对小反刍兽疫病毒引起的疾病诊断及疗效评估有重要指导意义。

【检验原理】

利用离心柱内硅基质膜提取RNA,在反转录酶的作用下,以RNA为模板,以引物为起点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火、中温延伸的循环,使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环,最终使扩增DNA片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳,经染色后,在紫外灯照射下,肉眼可见到DNA片段的扩增带。

【主要组成成份】

组成

25T/

50T/

PPRV RT-PCR反应液

375 μL×1

750 μL×1

PPRV 混合酶液

75 μL×1

150 μL×1

PPRV 阳性对照

40 μL×1

40 μL×1

PPRV 阴性对照

40 μL×1

40 μL×1

说明书

1

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注:阴性对照为偶蹄兽类基因组DNA,阳性对照为失去活性的小反刍兽疫病毒cDNA

【储存条件及有效期】-20以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

需自备的物品PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪可调移液器琼脂糖等相关试剂及设备

【注意事项】

1.病毒具有很强的感染能力,操作前必须准备好各种防御措施。

2.操作时须严格按照步骤进行,废物必须放入含消毒液的废物缸,以免污染实验室和工作人员。

3.为避免其他核酸的污染而出现假阳性,必须使用不含DNARNA的离心管、吸管、枪头、试剂和手套,操作人员须戴口罩。

【实验准备】

如果是提取病毒RNA,请选用RNase free Tip枪头和1.5 ml离心管或将枪头和离心管用0.1% DEPC水处理后再使用。

【操作步骤】

1.样品处理

(1). 适用标本类型:发病动物血液、空肠及小肠肠内容物及组织脏器(肠道组织、肠系膜及淋巴结等)和病毒培养液。

(2). 标本采集,方法如下:

a.血清:用一次性注射器取静脉血2-3ml,转至5ml 的干燥管中,密闭送检。

b.肠内容物:无菌条件下取肠道内容物约1g 左右,置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理盐水)5ml 离心管中,立即送检。

c.组织脏器:取发病动物肠道组织及肠系膜淋巴结等组织约1g,置一1.5ml的洁净离心管中,密闭送检。

(3).应避免标本间交叉污染。

(4).标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于28℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80以下,避免反复冻融。

2. 提取过程

QIAGENRoche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作

3. RT-PCR扩增

1)每份总体积20 µL15 µL RT-PCR反应液(用前混匀),3µL 混合酶液,2 µL模板RNA

例如:n份样品,配制n+1份,15×n+1RT-PCR反应液, n+1)混合酶液匀后取18 µL分装成n份,分别加入2 µL模板RNA,作好标记

2)在PCR扩增仪上进行以下程序:50 ℃ 10 min94 ℃ 3 min;循环94℃ 30 s55 ℃ 30 s72 ℃ 30 s,共35次;再72 ℃延伸7 min

4. 电泳

1.5 g琼脂糖放于500 mL锥形瓶中,加入1倍TAE电泳缓冲液100 mL(取2 mL 50倍TAE电泳缓冲液,用双蒸水稀释至100 mL),于微波炉中熔解,待冷却至50℃左右再加入50 µL染色液(自备)混匀。在电泳槽内放好梳子,倒入琼脂糖凝胶,待凝固后将PCR扩增产物中加入4µL上样缓冲液(自备)混匀后取10 µL点样于琼脂糖凝胶孔中,以110~120V电压于1TAE电泳缓冲液中电泳,紫外灯下观察结果。(注:染色液是2000×,上样缓冲液是6×)

结果判定

阳性对照出现191 bp扩增带、阴性对照无带出现引物带除外时,实验结果成立。被检样品出现191 bp扩增带为小反刍兽疫病毒阳性,否则为阴性。

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